1. 植物药材样品
对于中药材原植物,采集用作DNA条形码研究的实验材料应为健康、新鲜、没被真菌、细菌和病毒等感染的叶片、花、芽、果实或种子等组织或器官,要遵循一定的采样规范,注意样本个数、压制凭证标本、拍摄原植物照片及生境照片,并详细观察记录原植物形态特征,同时用GPS仪定位,记录海拔高度等。
一般来说,新鲜材料采集后最好及时提取DNA,如在野外,不便提取,则应尽可能快的放在避光的冷环境中,如液氮罐、干冰箱、冰壶、冰袋中,并尽快运回实验室处理备用。对于那些分布在远离实验室的交通极为不便的边远地区,要采集和及时运输新鲜材料提取DNA十分困难,目前普遍采取的取样和保存植物样品的方法是硅胶干燥法。
干燥时应注意以下事项:
(1)对于易失水的遗传物质材料(如纸质叶或幼嫩叶等),在采集后应立即放入柔软且通气性好的纸袋内,将纸袋直接放入装有硅胶且密封较好的自封袋中进行快速干燥,这样可使纸袋中的样品与硅胶能全面接触;同时有效防止干样品在运输过程中与硅胶碰撞发生破碎;样品与硅胶分开放置,硅胶可以反复利用。为保证遗传物质材料能快速干燥,同一份遗传物质材料不能过多,可放入不同的纸袋中进行干燥。一旦发现硅胶从深蓝色变成粉红色,要及时更换新的硅胶;
(2)对于不易失水的遗传物质材料(如革质叶或蜡质叶等),在采集后可放置一段时间(在叶片脱水前),然后再干燥;或者采集后立刻放入硅胶的自封袋中干燥。一般来说,硅胶与叶片的比例至少要10:1,以保证叶片在12h之内干燥;
(3)对于难于用硅胶快速干燥的遗传物质材料(如较厚或多浆的叶片或种子等),可将这些材料碎成小片后放入纸袋中用硅胶快速干燥;
(4)同种不同个体的遗传物质材料不能混在一起采集,应分开保存干燥;
(5)确保将遗传物质材料和具有其采集编号及其它信息的标签一起处理,干燥遗传物质材料的小袋上也应提供相同的信息,做到一一对应。
对于采集回来的新鲜样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在-80℃冰箱或直接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。对于已干燥好的植物材料,仍可置于塑料袋中,并留有少许硅胶,放在室温下的干燥器中几个月或长期储存在-80℃待用,但注意要密封好,以防吸潮。
2. 动物药材样品
动物样品的常用取样方法有三种,即伤害性取样、非伤害性取样和非损伤性取样(周丽等,2008)。伤害性取样就是通过杀死动物而获得新鲜的肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种取样方法对常见一般性动物来说或许可行,但对于珍稀濒危动物而言则不现实。非伤害性取样是通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾、腿或趾等可再生的组织结构做分析样品。虽然该方法不至于导致动物死亡,但对动物特别是珍稀濒危动物会或多或少造成伤害。非损伤性取样就是在不触及或伤害野生动物本身的情况下,通过收集脱落的毛发或羽毛、排泄物、角、鳞片、皮和卵壳等不同形式的分析样品的一种取样法。
对动物样品取样后,可以及时提取DNA,或者进行处理后有效保存一段时间。一般来说,对于动物新鲜样本或买回的动物药材可以晒干或晾干,然后再保存起来,最好冰冻保存,不过要注意避免吸潮,其DNA虽有一定程度的降解,但基本不会影响DNA条形码片段的扩增。此外,低温贮藏(用液氮或干冰冰冻,然后于-70℃或超低温下保存)已证明是保存组织最有效的方法。但是,在野外条件下,液氮和干冰以及超低温操作的不方便,限制了低温贮藏在野外采集中的应用,所以还可以采取一些非低温保存方法。
组织的非低温下保存方法常用有以下几种:
(1)乙醇保存是一种广泛应用的动物组织保存方法。乙醇保存组织时:将组织切成小块(越小越好),然后浸泡在95%乙醇中(最好是用纯乙醇),或将小型昆虫直接浸泡在纯乙醇中。浸泡1-2小时后,换用新的纯乙醇浸泡。浸泡数天后,换用大体积的纯乙醇浸泡并贮藏于阴凉地方(最好是在冰箱或4-8℃冷室中保存)。乙醇保存,4℃下贮藏比室温和-20℃下贮藏效果好。贮藏在70 %乙醇下样品DNA产量低且降解严重,但含50mmol/ L 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) 的70 %乙醇能有效防止降解(王义权等, 1999;蔡振媛等, 2006)。
(2)DMSO盐溶液(20% 二甲基亚砜,0.25M EDTA,用氯化钠饱和,pH 值为7.5)。据报道,鸟组织碎片在DMSO盐溶液中室温下能保存24周,从室温DMSO盐溶液保存的组织样品中提取的DNA质量与贮藏在-70℃下保存的组织样品一样。
(3)对于小型昆虫,丙醛保存样品DNA产量高但降解严重。标本用硅胶片干燥保存时,同样可以得到好的结果,但是DNA降解较严重,而用甲醇、甲醛和Carnoy溶液效果较差。在昆虫样品的保存中,要避免酸性防腐剂和固定液。
(4)用硫氰酸胍缓冲液(4M硫氰酸胍,2%N-十二酰-肌氨酸,50mM Tris-HCl(pH 7.4),50mM EDTA和0.01%β-巯基乙醇)保存各种组织和细胞样品,如昆虫、脊椎动物、软体动物、线虫等,经实验发现此缓冲液室温下可以有效保存组织样品。