1. 序列质量与方向
为确保DNA条形码序列的可靠性,序列拼接时,需对测序质量进行评估,去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
2. 序列拼接
应用CodonCode Aligner 2.06(CodonCode Co., USA)软件进行序列拼接及校对。首先,进行测序质量评估及预处理,即去除测序结果两端的低质量部分,并对剩余部分进行质量评估,如果满足质量要求,方可用于序列拼接。获得高质量序列后,对于ITS2序列,根据Hidden Markov Model (HMM)模型,去除序列两端5.8S和28S基因区,获得完整的ITS2基因间隔区序列;对于psbA-trnH,根据GenBank数据库中同科属物种psbA-trnH的注释,去除序列两端的psbA和trnH基因,获得完整的psbA-trnH基因间隔区;COI序列可直接进行后续分析。