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DNA提取流程

发布者:    发布时间:2013.01

  中药材DNA的提取都包括破碎细胞、释放核酸,DNA的分离和纯化,DNA的浓缩、沉淀与洗涤等步骤。
  1.试剂盒法(适用于动物、植物和真菌类药材)
  使用试剂盒与其他方法相比较更省时省力,方法相对简洁、易控,对于普通样品大多数实验室可采用商业化的试剂盒提取DNA。具体操作步骤参照相关试剂盒的说明书,使用时可根据需要进行调整,在大多数动物药材、植物药材中都获得了较为理想的结果。
  2.CTAB法(适用于植物和真菌类药材DNA提取)
  一般操作方法如下:
  ①原药材用无水乙醇擦洗表面后,用刀片取其内部组织0.02~0.1 g,在液氮中迅速研磨使呈糊状或粉状,在研磨时及时加入少许抗坏血酸钠和PVP干粉(加入量视样品材料而定),或用研磨仪进行研磨。
  ②将糊状或粉状物转入1.5~2 ml离心管后,加入600~1000 μl 65℃预热的2% CTAB提取液(2% CTAB,100 mM pH8.0 Tris-HCl,1.4 M NaCl,20 mM EDTA),0.1%-2% β-巯基乙醇,放入水浴锅中65℃保温30~60分钟(对于保存时间较久的样品,可适当增加水浴时间),其间温和混匀数次。
  ③12000 r/min离心10分钟。将上层的溶液转入另一个1.5 ml的离心管,加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液,在12000 r/min离心10分钟,小心取出上清液转入新离心管。
  ④重复上述步骤一次。
  ⑤取上清液,加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,置于-20℃ 30分钟或过夜。
  ⑥在12000 r/min离心10~20分钟收集沉淀,70%~75%乙醇清洗,室温下或超净工作台中自然风干DNA。
  ⑦将此沉淀加入合适体积的无菌双蒸水或TE缓冲液,4℃保存备用或放入-20℃保存。
  3.中药材DNA提取注意事项
  由于植物类中药材数量繁多,可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进。中药材植物细胞内储存了大量的种类繁多的次生代谢产物,例如多糖、多酚、乳汁、树脂等,这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀,形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变,严重影响DNA提取的产量与质量,以及后续的PCR扩增。对中药材中酚类物质的去除,一般是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚类成分氧化褐变。在提取DNA过程中加入β-巯基乙醇,可以抑制氧化反应,避免褐化。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP等能络合多酚和萜类物质,离心或氯仿抽提除去,有效地防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐。其用量视杂质的多少而定,一般在1%~6%之间。PVP同时能有效去除多糖。因此将PVP和β-巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。必要时,选择合适的试剂盒进一步纯化DNA。对于多糖含量高的类群,CTAB浓度可提高至3%。高浓度盐也可以除去多糖,在氯仿-异戊醇(24∶1)抽提后的水相中加入0.5倍体积的5 mol/L NaCl,然后再加2倍体积的乙醇使DNA沉淀,此时大部分多糖仍在上清液中,这种简单、迅速的方法可有效去除植物DNA中的多糖。此外,稀释DNA提取液也是排除多糖抑制作用的有效途径。
  根、根茎、皮、藤木类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高,在研磨时极易氧化变褐,而且蛋白质类含量较高,DNA提取溶液较为浑浊,DNA外观有一定颜色,产率较低。所以在提取根及根茎类药材时一定要注意多糖、多酚的处理。提取根及根茎类药材时水浴时间一般为90分钟,CTAB的用量为3%。此外,根茎类药材由于含纤维和贮藏物质等较多,需较多样品量才能提取到需要的DNA,因此可用大的离心管5 ml 或15 ml 抽提。皮类中药材组织中富含薄壁组织和纤维等,加液氮不易研磨成细粉,需适当增加样品量。此外,多糖、多酚类物质含量也较高,因而也要注意提高CTAB浓度,并增加β-巯基乙醇和PVP的含量。
  叶、花、全草类 该类药材采用CTAB法或试剂盒一般都能得到比较理想的结果。但对保存时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间,同时适当降低水浴温度,如延长水浴时间,56℃水浴过夜。
  果实、种子类 果实及种子类中药材中多富含油脂,研磨时易被氧化,且易黏着在研钵壁上,损失较大,所以提取时需增加样品量。另外对粉碎后的材料可用丙酮浸提,去除脂溶性酚类化合物。
  动物药材 前期处理非常重要,动物肌肉类药材如海龙、蛇类、蛤蚧、蛤蟆油等,在消化前需进行紫外杀菌处理,充分捣碎,可以用1.5 ml 离心管微量抽提。含有脂类较多的动物内脏器官如蛤蟆油,消化前取适量用不含蛋白酶K和SDS的缓冲液浸泡,在消化缓冲液中SDS含量需稍多加一些,有利于脱去脂类,但不能太多,否则会影响缓冲系统中的pH,酚-氯仿抽提时不分层。骨甲类药材如龟甲、鳖甲、鹿茸和塞龙骨等,这类药材由于DNA含量稍少,样品量须增大,一般用大的离心管(5 ml或15 ml)抽提,在消化前还须进行脱钙处理。
 

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